近日，一个来自中国的团队在Journal for ImmunoTherapy of Cancer（IF=8.4）上发表了题为“Single-cell transcriptome analysis revealed a suppressive tumor immune microenvironment in EGFR mutant lung adenocarcinoma”的文章。作者探讨了表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）在非小细胞肺癌（Non-small Cell Lung Cancer, NSCLC）免疫治疗中扮演的角色，利用单细胞测序技术，对EGFR突变型和EGFR野生型肺腺癌患者的肿瘤微环境差异进行测绘和对比，针对EGFR突变型患者对免疫治疗低响应的原因做出解析，并利用多色荧光免疫染色技术对测序结果进行了直观而清晰的验证。

NSCLC在肺癌患者中占据了80%以上的比例,依据肿瘤起源的细胞类型不同，NSCLC又分为肺腺癌和肺鳞癌，而既往研究显示EGFR突变与肺腺癌的发生呈高度正相关。

EGFR是人表皮生长因子受体（Human Epidermal Growth Factor Receptor，HER）家族的成员，也是受体酪氨酸激酶的一种(Receptor Protein Tyrosine Kinase, RPTKs)，被发现参与细胞增生、肿瘤血管生成等过程的调控。当配体与EGFR结合，EGFR由单体转变为二聚体，活化自身酪氨酸蛋白激酶，自磷酸化胞内的酪氨酸残基，进而激活下游的多条分子通路, 诱导细胞增殖。突变型EGFR会处于持续活化，受体下调机制失能，下游信号通路异常激活，这一过程与恶性肿瘤的发生和进行密切相关，也是NSCLC的常见诱因。

临床数据显示，免疫疗法对EGFR突变的NSCLC患者疗效显著低于EGFR野生型的患者，而近年的研究显示，患者对免疫疗法的响应程度与其肿瘤突变负荷（Tumor Mutational Burden，TMB）有关，高TMB的患者常常获得更好的免疫治疗效果，而EGFR突变患者的TMB相对较低。由此，作者以EGFR突变型和EGFR野生型患者的肿瘤微环境差异为立足点，对EGFR突变型患者肿瘤的免疫环境特点和可能存在的治疗靶点进行了深入的探索研究。

作者采集了来自5个 EGFR 突变患者和 4 个 EGFR 野生型患者的超过50000个细胞进行单细胞测序，对测序结果进行降维聚类后，解析出了上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、单核细胞、T细胞/NK细胞、中性粒细胞、B 细胞，肥大细胞8种细胞类型。并统计了不同类型细胞在EGFR 突变患者和 EGFR 野生型患者中的存在比例，EGFR 突变患者有更高水平的单核细胞、肥大细胞和内皮细胞水平和更低水平的中性粒细胞和成纤维细胞水平，T细胞/NK细胞则在两类患者中水平相当。

针对上皮细胞，在9067个上皮细胞中解析出了10个肿瘤细胞亚型和3个非肿瘤亚型，通过差异表达基因分析，作者发现EGFR突变患者上皮细胞中有更高的CCL18、CXCL1和CXCL3表达水平，EGFR野生型患者则有更高的 IL-7和IL-8表达水平，说明EGFR野生型患者的上皮肿瘤更容易引起CD8+T细胞的增殖。

作者进而联合公共数据库中，免疫治疗后样本的单细胞测序数据进行比对分析，发现EGFR突变患者的肿瘤细胞与免疫治疗无效样本有相似特征，而EGFR 野生型患者的肿瘤细胞与免疫治疗有效样本的特征更为接近。拟时序分析则显示，EGFR的突变导致了正常上皮细胞分化差异，从而抑制了各类免疫细胞的功能。

针对T细胞的进一步解析发现，相对于EGFR野生型患者，EGFR突变患者的CD8+组织驻留记忆细胞数量，以及与B细胞趋化有关的CXCL13表达水平显著降低，多重免疫荧光染色也在组织原位验证了这一发现。这一差异意味着EGFR突变患者无法有效形成三级淋巴结构，这很可能是EGFR突变患者对免疫疗法响应度低下的原因。

通过细胞间通讯分析，作者发现CD8+组织驻留记忆T细胞，可能与成纤维细胞、CHIT1 高表达肿瘤巨噬细胞、LAMP3+树突状细胞等存在着相互作用，CHIT1 高表达肿瘤巨噬细胞和成纤维细胞可能都参与促进CD8+ T细胞向CD8+组织驻留记忆T细胞转化，而这些过程在EGFR突变患者中缺失。此外包括PD-1和PD-L1在内的多种免疫检查点相关分子，都被发现在EGFR突变型患者中显著降低，这一差异也得到了多色免疫荧光技术的验证。

在这部分工作中，作者利用单细胞测序和多色免疫荧光技术，描绘了EGFR突变患者和EGFR野生型患者免疫微环境的差异，为EGFR突变的肺腺癌研究和治疗提供了新的思路和依据。