三级淋巴结构对于评估和预测免疫治疗的意义

三级淋巴结构(TLSs)是在非淋巴组织中发现的淋巴结构（有组织的免疫细胞聚集物）。TLSs不存在于生理条件下，但出现在慢性炎症的背景下，如自身免疫性疾病、慢性炎症疾病和肿瘤。TLSs促进免疫细胞流入肿瘤部位，除了少数个例外，肿瘤中TLSs的存在与免疫治疗后的更好的预后和临床结果相关，尽管被认为很重要，但其形成的驱动因以及这些结构对肿瘤内免疫反应的贡献仍未完全了解；随着空间转录组/单细胞测序+多色免疫荧光技术的出现，TLSs的神秘面纱逐渐被揭开。

文献1：三级淋巴结构的组织及形成、功能

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肿瘤组织中三级淋巴结构模型及组成

三级淋巴结构主要包含B细胞、滤泡树突状细胞、T细胞、成纤维网状细胞、基质细胞、树突细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和内皮细胞。滤泡状树突细胞通常位于B细胞中心，表达各类受体，促进抗原递呈至B细胞，并驱动B细胞表达高活性的抗体；内皮细胞位于TLS边缘，T细胞区域内，也有一些成纤维细胞，与体内微环境结合，调节T细胞的功能。

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肿瘤TLS形成的模式图

慢性炎症部位附近的基质细胞或者淋巴细胞分泌趋化因子CXCL13与IH-7，招募附近的淋巴细胞诱导因子，淋巴细胞诱导因子表达LTα1β2，结合到位于基质细胞的LTβR受体上，促进基质细胞分泌VEGFC、HEV形成。此外，淋巴组织诱导因子分泌的IL-17,基质细胞上的受体IL-17R结合，再促进基质细胞分泌其他的趋化因子，例如：CXCL12CXCL13 CCL19CCL21等，最终招募附近的HEV的淋巴细胞，形成T细胞区域和B细胞区域，淋巴组织诱导因子也被T17细胞、B细胞或者M1型巨噬细胞替代，形成成熟的TLS结构。

TLS的功能：TLS在抗肿瘤的过程中起到了积极作用，关于TLS提高肿瘤免疫的机理和临床应用也有诸多案例;HEV招募各种免疫细胞，包括T细胞，B细胞；B细胞也招募各种免疫细胞：T细胞，NK细胞，DC细胞，成熟的DC促进对T细胞和B细胞的抗原递呈，但也有报道：TLS在某些环境下，在可以被肿瘤细胞应用，促进肿瘤细胞的淋巴浸润，导致肿瘤的淋巴转移，抑制部分免疫反应也值得再去探索。

文献2：TLS评估多种肿瘤类型免疫治疗反应

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mIHC评估三级淋巴结构的成熟度以及与预后生存率的关系

为了评估TLS对免疫治疗的预测价值，文献2中对接受抗PD-L1/PD-1治疗的三个独立癌症患者队列进行大规模回顾性分析，利用多重荧光免疫组化技术（mIHC），双盲评估肿瘤免疫微环境和TLS的成熟度。研究者认为，成熟的TLS（mTLS）由B细胞和CD23+滤泡树突状细胞（DCs）组成，与一个较小的CD4+和CD8+混合T细胞区相连。TLS中的B细胞通过分泌抗体和细胞因子对抗PD-L1/PD-1的反应起关键作用。DCs通过调节抗原加工和呈递来调节T细胞功能。B细胞的功能依赖于TLS的成熟度，促肿瘤或抗肿瘤。在mTLS中，B细胞和DCs可以通过向CD8+细胞提供肿瘤抗体来更好地训练CD8+T细胞。

该研究入组328例患者，涉及11个癌种，在大多数肿瘤类型中都观察到具有良好的高相关性似乎不受特定肿瘤类型的驱动。mTLS阳性肿瘤更多地被CD8+T细胞浸润，mTLS的存在与CD8+T细胞高浸润的肿瘤的预后改善显著相关，与PD-L1表达状态无关；但对于CD8+T细胞低浸润的肿瘤患者而言，无论TLS状态如何，其预后都较差。根据mTLS和CD8+T细胞的表达情况，可以进一步明确实体瘤中PD-L1阳性和PD-L1阴性患者的获益可能性。进而得到新的发现：治疗前患者样本中存在成熟TLS可被视为患者对免疫治疗反应的预测指标，TLS没有形成或未成熟组的肿瘤在反应率方面没有区别。mTLS的预测价值可能不局限于特定肿瘤类型，在大多数肿瘤类型中都观察到具有良好预后的高相关性。

文献3：TLS可作为软组织肉瘤（STS）免疫反应的标志物

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本研究探索了软组织肉瘤（STS）响应免疫治疗的机制，研究团队从分析软组织肉瘤肿瘤微环境中免疫细胞组成入手，分析了608个软组织肉瘤的基因表达谱。根据免疫相关基因表达的多少，将STS分为五类不同的肉瘤免疫类型（sarcomaimmune classes，SICs），标记为A、B、C、D和E。免疫反应从弱到强。

对STS肿瘤组织进行组化和多色免疫荧光染色，发现免疫反应强的SICE中存在大量TLS，且TLS表现为更成熟的次级滤泡样TLS，有TLS的肿瘤中也有更多的T细胞和B细胞的浸润；而免疫反应弱的SICA中基本不含有三级淋巴结构。这表明三级淋巴结构可以作为免疫反应强的软组织肉瘤的标志物，并且与肿瘤患者预后呈正相关。

最后作者探索免疫微环境组成是否也能预测患者对PD1等免疫检查点阻断疗法的响应性。使用pembrolizumab（PD1单抗）对47个软组织肉瘤患者进行治疗，结果显示SICE组对ICB治疗有更好的响应和总体生存情况（图4）。这表明这种新型软组织肉瘤分类方法有助于预测肿瘤患者对PD1免疫疗法的敏感性。也就是说，STS中免疫细胞浸润的多少以及类型与肿瘤的预后以及对CPI治疗的响应密切相关。

文献4：TLS中B细胞浸润与免疫相应的相关性

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作者从一项免疫检查点阻断疗法（ICB）治疗联合新型辅助治疗的黑色素瘤临床二期试验队列入手，为进一步理解病人响应ICB治疗的具体机制，对获得的黑色素瘤病人肿瘤样本进行RNA-Seq。分析发现，对ICB治疗响应患者肿瘤组织中，B细胞相关基因如MZB1,JCHAIN和IGLL表达增高，FCRL5,IDO1, IFNG andBTLA等能影响B细胞功能的基因也在ICB治疗响应病人肿瘤样本中富集。分析另一肾细胞癌队列，研究团队也发现类似的B细胞相关基因在ICB治疗响应患者组织中富集。

研究团队对肿瘤组织进性免疫染色，评估B细胞在肿瘤组织中的分布以及和三级淋巴结构（tertiarylymphoidstructures，TLSs)的关系。在黑色素瘤队列中发现，ICB治疗响应者肿瘤组织中的CD20+B细胞和TLSs密度以及TLSs和肿瘤面积比例都高于非响应者，尤其是在治疗刚开始的早期阶段。进一步的组织结构分析发现，在响应者中，CD20+B细胞定位于肿瘤的TLSs中，并且和CD4+,CD8+和FOXP3+T细胞以及CD21+滤泡型树突状细胞以及MECA79+高内皮静脉等共定位（图2）。且响应者肿瘤组织中的TLSs，呈现成熟的次级滤泡样TLSs，存在有CD21+滤泡型树突状细胞和CD23+生发中心B细胞。在肾细胞癌队列中也有类似的发现。总结：通过分析转移性黑色素瘤和肾细胞癌队列肿瘤组织中的免疫细胞组成，发现B细胞和TLSs和患者对免疫治疗的响应呈正相关

1.Tertiary lymphoid structures in the era of cancer immunotherapy.Sautès-Fridman C, et al. Nat Rev Cancer. 2019.

2.Mature tertiary lymphoid structures predict immune checkpoint inhibitor efficacy in solid tumors independently of PD-L1 expression. Vanhersecke, L. et al.Nature Caner 2, 794–802 (2021)

3.B cells are associated with survival and immunotherapy response insarcoma. Petitprez, F. et al..Nature577, 556–560 (2020).

4..Bcells and tertiary lymphoid structures promote immunotherapyresponse. Helmink, B. A. et al. Nature 577, 549–555 (2020).

5.Tertiarylymphoid structures improve immunotherapy and survival in melanoma.Cabrita, R. et al. Nature 577, 561–565 (2020).