胃癌肿瘤内高水平的GIRT+CD4 T细胞跟预后不良相关
本文是上海交通大学医学院附属仁济医院在iScience发表了题为“High-level of intratumoral GITR+ CD4 T cells associate with poor prognosis in gastric cancer”的文章，影响因子：6.1074，文章阐述了胃癌中的高水平GITR阳性CD4 T细胞与胃癌的不良预后相关，本文主线清晰，实验设计简洁合理，从单细胞数据分析入手，经不同组织体外实验，流式及多色免疫荧光验证，明确GITR与胃癌预后不良相关，给需要类似研究某一肿瘤微环境相关指标参考。弗瑞思病理承担了文章中多色免疫荧光部分的工作。
期刊名称：iScience
影响因子：6.1074
研究背景： 作者先总结了糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体蛋白（Glucocorticoid-induced TNFR-related protein，GITR） 在前人的研究：小鼠模型中出现了明显的抑瘤作用，但在临床实验中可能由于表达方式不同并没有出现相似的效果；作者通过单细胞数据分析及后续流式实验、多色免疫荧光实验得到验证：GITR与胃癌不良预后有关；对于他的作用机制还需要进一步研究。
其他相关指标：
GITR在调节性T细胞和活化T细胞中高表达，在初始T细胞和记忆T细胞中低表达； 其配体GITRL主要由抗原提呈细胞如树突细胞和B细胞表达； 活化后主要功能为减少调节性T细胞数量并下调其免疫抑制的功能，同时增加效应T细胞的活化和增殖，
调节性T细胞（Regulatory cells，Tregs ） 发挥免疫抑制作用的一类免疫细胞，避免免疫反应的过度发生，在肿瘤过程中常因其免疫抑制作用产生促瘤效果；其标记物为CD4+CD25+Foxp3+；
CD4为辅助性T细胞（Helper T cell，TH ）和调节性T细胞的通用标记物；
CD25和Foxp3为调节性T细胞的特异标记物；
CD4+CD25-Foxp3-的T细胞称为常规CD4 T细胞（Conventional CD4 T cells，Tconv ）；
细胞毒性T细胞（Cytotoxic T lymphocyte，CTL）发挥免疫杀伤功能的一类免疫细胞，是进行抗瘤作用的主要细胞类型，主要标记物为CD8+；
研究思路/技术路线：
scRNA-seq ：作者分析了26个胃癌肿瘤组织+11个癌旁组织进行单细胞测序，测序结果解析出了13种主要的细胞类型；胃癌肿瘤组织中的CD4+ T细胞相比癌旁组织中的CD4+ T细胞，GITR表达显著上升； GITR+Tregs的LAYN、TNFRSF9、IL2RA、CCR8等免疫抑制相关分子表达上调，提示GITR与肿瘤细胞的免疫逃逸以及胃癌不良预后相关；
FC流式细胞实验：取肿瘤组织、癌旁组织、外周血（PBMCs）和肿瘤引流区淋巴结（TDLN）进行流式细胞测试； 在各类组织中，GITR在Tregs中的水平都最高，其次为Tconv 和CD8 T细胞； 在Treg群体中，来自肿瘤组织的细胞群GITR阳性比例最高 (71.58%)，其次为癌旁组织(60.64%)， TDLN (53.46%)和PBMCs (12.62%)，证明Tregs是肿瘤微环境中GITR的主要来源。
作者进一步分析了GITR在Tregs细胞， Tconv细胞和CD8 T细胞中的百分比相关性，虽然GITR的表达在不同患者中存在差异，但我们发现GITR在Tregs细胞和 Tconv细胞上的表达在不同组织中都有很强的相关性，还发现男性患者 Tconv上的GITR的表达高于女性，在早期T期肿瘤和增殖能力较强的肿瘤中，Tconv细胞上的GITR表达显著升高等一系列发现，其次：胃癌患者的GITR+Treg细胞表达更高的FOXP3和CD25，这代表了更稳定的Treg细胞，GITR+ Tregs中还高表达免疫检查点分子CTLA-4、PD-1、OX40、LAG3和CD39； 与CD8 T细胞的共培养实验显示，GITR+ Treg可以抑制其扩增，具有更强大的免疫抑制功能。
GITR+ Tconv的免疫效应相关因子IFN-g和TNF-α表达下调，免疫调节相关因子CTLA-4表达上调， 并有和Tregs类似的免疫检查点分子表达范式； 与GITR+ Tconv和GITR+ Tregs 不同，GITR+ CD8 T细胞表现出了更高的活化和肿瘤杀伤水平；
多色免疫荧光：组织原位展示了不同亚型的调节性T细胞，数据显示高水平的GITR+ CD4 T细胞（Tregs和Tconv） 和患者预后（总生存期）呈负相关；通过生物信息学构建的另外两个队列的结果，也同样显示：高水平的GITR+ CD4 T细胞（Tregs和Tconv） 和患者预后（总生存期）呈负相关。
染色panel：CD4、Foxp3、GITR
Tregs：CD4+Foxp3+
Tconv：CD4+Foxp3-
细胞免疫荧光：一般来说，免疫检查点在细胞表面表达，并通过与它们的配体结合而起作用。 流式细胞术分析显示有部分表达是在核内，作者利用共聚焦显微镜进一步研究了GITR在Treg细胞中的位置。胃癌患者Tregs的总GITR（GITRTOT） 水平明显高于膜GITR（GITRSUR）水平， 提示有部分GITR在细胞内部表达； 肿瘤组织中Tregs的GITR大多分布于膜， 外周血中Tregs的GITR大多分布于细胞内部；GITR的细胞定位和其不同功能的关系还值得进一步研究。
