肿瘤微环境免疫特征分析和肿瘤出芽与结直肠癌患者预后结果显著相关。在结直肠癌患者诊疗过程中，TNM分期仍是预后判断的金标准，是选择治疗的基础。然而，即便相同TNM分期患者的术后生存周期存在明显差异，一些III期患者比II期患者具有更好的临床结果。越来越多的研究表明，免疫评分(Immunoscore)系统能够更好的预测结直肠癌患者的生存周期。此外，肿瘤出芽在结直肠癌研究中表明也具有潜在的预后预测价值。无论在疾病最初的病理阶段还是其他，较高的出芽等级都与较高的复发率和较差的整体生存率相关。
先前的研究表明，在肿瘤微环境中实现自动量化免疫评分，能够实现比主观手动报告更高水平的标准化。肿瘤出芽也同样可通过自动化图像分析进行标准化的评估。下面我们来讨论下如何使用数字病理图像分析平台HALO实现肿瘤出芽和免疫评分的量化分析。
1、了解肿瘤出芽(Tumor budding)
肿瘤出芽是一种与多种癌症相关的病理现象，与消化系统恶性肿瘤的淋巴结转移、淋巴管侵犯及预后有关，对预后具有较高的预测价值。肿瘤出芽的定义一直存在争议，被广泛接受的是存在于肿瘤浸润性前缘、散在的呈未分化形态的单个肿瘤细胞或4个细胞构成的小灶状肿瘤细胞群。
组织学上， 肿瘤出芽多见于分化良好的腺癌，在肿瘤浸润的前缘组织中可见单个或小灶性肿瘤细胞群从肿瘤性腺体分离， 呈细线样或小的条索状进入间质。肿瘤出芽细胞及胞核异型性大，形态多不规则，细胞质较丰富，呈嗜酸性，常发生融合，核深染。尽管肿瘤出芽在H&E染色下即可观察到，但某些情况下也难以辨认。细胞角蛋白免疫组织化学的应用可以方便地识别和快速分类肿瘤出芽，并提高重复性。大多数学者选择采用IHC染色标记肿瘤出芽细胞，从而减少对肿瘤出芽的判断错误。
目前国际肿瘤出芽共识会议(International tumor budding consensus conference，ITBCC)对肿瘤出芽的标准化判定方法为：根据出芽数量将患者分为低、中、高级别，出芽数分别为0~4，5~9，≥10 芽(×20视野，即0.785 mm2区域)。
(A) High-power image (250×) of tumor budding at the invasive front of colorectal cancer as visualized by pancytokeratin (brown) IHC. (B) Tumor buds as seen in a standard hematoxylin and eosin (H&E) stain (250×).
2、了解肿瘤免疫评分（Immunoscore）
肿瘤细胞处在一个比较复杂的微环境中。肿瘤微环境中免疫细胞在机体对抗肿瘤中发挥着非常重要的作用。各种免疫细胞群的密度、类型及其空间位置分布对于预测肿瘤患者预后具有重要意义。由此有学者提出“免疫结构”（Immune contexture）的概念，该结构包括肿瘤中心区域(Centre tumor, CT)和肿瘤浸润交界区域(Invasive margin，IM)中的CD45RO+记忆性Ｔ细胞、CD8+细胞、三级淋巴结构和其他功能黏附相关分子（黏膜地址素细胞黏附分子１、细胞间黏附分子-１、干扰素-γ、颗粒溶解素和颗粒酶Ｂ等）。
通过系统的研究，Galon等提出免疫评分这一概念，即，通过对两区域（CT和IM）的CD3+和CD8+精确定量计算出最佳临界值，每个区域的各自细胞高密度记为１分，低密度记为０分。然后，将CD3+和CD8+细胞分别在CT和IM的密度评分相加求和，得到免疫总分（0~4分）。该方法目前可能是包括早期结直肠癌在内的一些肿瘤最好的DFS和OS预测预后因素，适应于肿瘤免疫反应，为肿瘤治疗提供了的评价标准。
(A) A section of colonic cancer immunostained for CD3, showing the regions of interest (the CT and the IM). (B) An enlargement showing CD3+ cells (stained brown) in the stroma and within tumor glands (original magnification ×300). (C) The tumor (shown in red) and the IM (shown in brown) are selected to determine the Immunoscore. (D) The Immunoscore is based on the numeration of CD3 + and of CD8 + cells in the tumor and the IM.
使用HALO计算肿瘤出芽及免疫评分
以下使用结直肠癌多重免疫荧光染色(CD3, CD8, PanCK,DAPI)来示例肿瘤出芽及免疫评分的计算方法：
图像标注
HALO具有快速识别标准组织的注释工具，利用HALO flood tool 标注整张组织分析区域（Whole slide image）以及肿瘤浸润前沿（Invasive front）。基于Invasive front创建肿瘤侵袭性边缘（IM，Invasive Margin），其被定义为从浸润边界内外分别500μm范围宽度的区域。肿瘤核心（Centre tumor）被定义为除IM区域外的整个肿瘤区域。
细胞识别分割
基于HALO High-Plex FL 模块对整张切片上所有细胞进行自动识别。HALO平台能够快速的识别整张切片上所有阳性细胞并获取逐个细胞的形态学数据及空间位置信息。无论胞核、胞膜、胞浆的细胞着色，均能快速的进行细胞的定量识别。
淋巴细胞浸润分析
基于设置的阳性阈值，快速识别出整张切片上CD3,CD8阳性细胞，所有患者样本保持使用同一算法，可保证分析结果的客观性。在肿瘤核心及肿瘤侵袭性边缘分别自动定量其CD3+，CD8+ 细胞数量及密度，用于评判其于预后的关系。
CD3、CD8细胞定量原始图及分析结果示例
免疫评分评估分析
根据Galon及同事描述的方法进行免疫评的计算。首先分别计算每平方毫米区域内的CD3 和CD8 免疫细胞数量及密度，并根据所得到的CD3/CD8 阳性细胞数量通过最优分割法分析得出最佳临界值， 进而将患者分为高密度和低密度两群， 从而进行评分，高密度计1分，低密度计0 分。然后，根据每个患者样本的所有分数之和计算免疫分数，患者将分为两组：高免疫分数>2和低免疫分数<2。
基于HALO计算免疫评分能够快速的获取肿瘤侵袭性边缘区域并通过Infiltration Analysis 模块得到肿瘤CT及IM区域的细胞数量及密度，能够极大的加快数据的分析速度。
肿瘤出芽分析
基于HALO Tissue classifier 机器学习算法对样本组织进行分型，将样本组织分为肿瘤（Tumor）及非肿瘤（Nontumor）区域。HALO能够基于组织的光密度、组织形态特征及其之间的相互关系对样本进行快速的分型，在肿瘤学的研究中非常的适用。
随后，使用High-Plex FL 模块基于Pan-ck染色对肿瘤细胞进行定量分析，在肿瘤侵袭性边缘IM区域内，即感兴趣的肿瘤萌芽区域运行该算法。
在算法调试时，选择刚刚调试好的Tissue classifier算法，在class list 中选择tumor区域。最后在Classifier output type 选项中选择Reagions as Objects选项。即可计算每个肿瘤区域内的肿瘤细胞数。
在检测到的肿瘤区域中，使用上述方法检测出肿瘤细胞，在分析时对所有样本使用同一算法进行计算，保持分析的客观性及可重复性。TB被归类为含有之多4个PanCK+细胞的肿瘤细胞簇。待算法分析完成后，在Object Actions数据框中进行筛选，选择所有肿瘤细胞数在1~4之间的肿瘤细胞簇，即可快速的计算出整张组织中Tumor budding 的数量。然后从算法导出 TB 密度 （TB/mm2） 和，在分析过程中需排除Mucin Pools 及坏死区域组织。
肿瘤出芽及淋巴细胞的空间关系分析
基于HALO Spatial Analysis 模块，对 TB及CD3+、CD8+细胞的空间关系进行定量分析。首先将淋巴细胞和TB的空间坐标被导入到HALO软件的空间图中。在此分析中，可以定量分析距离TB一定半径范围内CD3+、CD8+淋巴细胞的数量。从而在肿瘤组织空间层面上分析肿瘤出芽及淋巴细胞于患者生存期的关系。
肿瘤出芽与淋巴细胞密度的关系分析
使用Spearman 相关系数，可以对结直肠癌患者样本组织中淋巴细胞及TB的密度相关性进行分析。通过相关性分析查看不同细胞密度及TB密度变量间的相关性，从而发现有价值的生物标记物。下图为一组样本的分析示例图，该图中反应TB数与所有淋巴细胞密度之间存在弱负相关性,无论分布模式（即IM，CT，WTS），亦或是淋巴细胞亚群（CD3+，CD8+）。使用斯皮尔曼相关组对结核病号进行了与训练组淋巴细胞密度的关联测试。表明TB数与所有淋巴细胞密度（r<0）之间存在弱负关系，无论分布模式（即IM、CT、WTS）或淋巴细胞亚群（CD3+或CD8+）。
TB数和淋巴细胞密度的Spearman 相关系数矩阵
肿瘤出芽对结直肠癌的预后评估具有重要的意义，但由于缺乏标准化的评估方法，其常规临床评估尚未建立。大多数研究都依赖于人工定量，通常基于对高倍率感兴趣的区域的主观选择。细胞角蛋白IHC的使用已被证明能改善TB的检测，并提高观察者间的可重复性。此外，国际肿瘤出芽共识会议推荐使用细胞角蛋白免疫组化对肿瘤出芽进行识别，以帮助在具有挑战性的病理中进行TB的定量，例如在具有强烈炎症的肿瘤区域或者破裂的腺体组织中。
数字病理图像定量分析的方法可以消除了人的主观性，并避免了有经验的病理学家花费宝贵时间量化整个切片组织大片区域内细胞量化的过程。使用HALO图像定量分析作为肿瘤的研究，量化肿瘤微环境中免疫细胞的类型、密度及空间位置关系，是极其有利的助手工具。
参考文献
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