在单个细胞水平上研究 RNA 可以提供有关细胞动态基因表达的重要信息。当在整个组织背景下进行原位分析时，研究人员可以鉴别与疾病状态相关的异常基因表达，例如癌症和神经系统疾病。
RNAscope® (Advanced Cell Diagnostics Inc., Hayward, CA, USA) 于 2012 年推出，彻底改变了 RNA 原位研究的能力。利用独特的探针设计来确保靶标特异性信号的放大，RNAscope 原位杂交 (ISH) 分析可在细胞内产生点状信号点。在 RNAscope 检测之后，需要解决定量和数据解释的问题。用肉眼手动计数 RNA 探针信号既耗时又费力，而且容易被主观解读影响，尤其是在出现聚簇信号的情况下。数字图像分析提供了一种自动化、一致的方法，可以从 RNAscope 检测中生成定量数据。
本文小编将介绍如何使用 HALO® 平台提供的 ISH 和 FISH 模块分别定量评估明场和荧光RNAscope 检测。【明场 ISH 定量】
HALO ISH 模块用于对使用明视场扫描仪或显微镜成像的组织切片中最多两种标记的 ISH 探针进行定量。ISH 模块可以配置为报告每个感兴趣区域的探针拷贝或每个细胞的探针拷贝，具体取决于用户偏好和核染色的质量。该模块对单个探针拷贝进行计数，并自动对聚簇型探针进行分割，以获取准确的信号计数。报告了探针 1 与探针 2 的比率，使用控制探针来规范化信号计数时，这一点尤其重要。最后，根据细胞包含的探针拷贝数，将细胞分类为 0、+1、+2、+3 和 +4，并根据这些信息计算 H -score分数。重要的是，ISH 模块中的默认分类设置了 ACD Bio 推荐的用于 RNAscope 信号定量的设置。
原位 RNA 检测提供了探索免疫细胞与肿瘤细胞之间复杂相互作用的能力，这是癌症研究中的一个重要应用。图 1 显示了这方面的一个示例，其中使用了 RNAscope ® 检测对非小细胞肺癌肿瘤和基质细胞中的免疫检查点标记物 PD-L1 和 CTLA4 进行研究。在这里，我们可以鉴定三种感兴趣的细胞群，PD-L1 高表达的肿瘤细胞（绿色探针）、PDL-1 低表达的肿瘤细胞和通过高水平 CTLA4 表达鉴定的T-淋巴细胞（红色探针）。在这种应用中，ISH 模块报告的细胞分类特征和所得 H -score分数用于定量组织中PD-L1 高和低肿瘤细胞的数量以及 CTLA4 阳性免疫细胞的密度。如果需要，HALO 注释工具或组织分类模块可用于分别自动生成肿瘤和间质内的结果。
除了生成所有细胞的汇总数据外，还可以将 HALO 设置为报告每个单独细胞的信息。使用 HALO 的空间分析模块，这些“逐个细胞”数据可用于评估表达异质性和不同细胞群彼此之间的空间分布。例如，分析 CTLA4 阳性免疫细胞与 PD-L1 高和低细胞之间的距离，或肿瘤边缘周围 CTLA4 阳性细胞的密度可能是有意义的。
图 1. 非小细胞肺癌的 RNAscope® 检测，探测了免疫检查点标记物 PD-L1（绿色）和 CTLA4（红色） (A)。HALO 标记图像显示在 (B) 和 (C) 中，这些图像显示了 ISH 模块检测到的探针位置 (B) 和检测到的细胞位置 (C)。(B) 中显示的橙色和红色点表示单个和成簇的红色探针，两种深浅的绿色点相当于绿色探针。细胞标记颜色取决于其包含的红色和绿色探针的数量。细胞质环显示为黑色，其大小可由用户定义。
【荧光 FISH 定量】
当需要同时评估多个靶标时，荧光 RNAscope 检测优于明场检测。HALO 的 FISH 模块 可以定量每个细胞或每个区域上多达四种荧光探针的探针信号和共表达，并具有与明视场 ISH 模块中描述的相同的分析选项和输出，包括基于 ACD Bio 推荐的 RNAscope 评分指南的细胞分类（0、1+、2+、3+ 和 4+）。
RNAscope 检测在神经科学中的应用越来越广泛。图 2 显示了一个示例。在这里，HALO FISH 模块用于定量小鼠大脑中的两种 RNAscope 探针，即多巴胺受体 D1 (Drd1) 和多巴胺受体 D2 (Drd2)。FISH 模块产生的代表性直方图如图 2B 所示
HALO 中可用于 FISH 分析的其他模块包括FISH 扩增和缺失分析模块，用于定量多达两个荧光标记的 DNA 探针来测量扩增或缺失，以及 FISH 分离与融合分析模块，用于测量使用分离融合探针检测到的基因重排。
【 结 论 】
标准化的信号定量方法对于可靠解释 RNAscope 检测至关重要。HALO ISH 和 FISH 模块提供了明场和荧光 RNAscope 检测的定量分析。虽然图 1 和 2 中显示的图像是具有代表性的视野，但值得注意的是，可以使用 HALO 平台将优化的 ISH 和 FISH 分析设置应用于整个组织切片以及跨批次的图像，从而提供了一种以高通量方式生成定量数据的方法
【参考文献】
1. Wang. F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin- fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 2012. 14:22–29.
2. A Guide for RNAScope® Data Analysis, Advanced Cell Diagnostics, Inc, 2017.
